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仪器信息网 2019/09/19 09:54:53 点击 900 次
默克工艺
[导读] 穆利斯教授自己也不会想到,脱胎于他这番奇思异想的PCR技术会成为日后所有生物实验室不可或缺的技术手段和工具,并逐渐发展成荧光定量PCR和数字PCR,叩开了精准医学的大门。

“高度创新,非常重要,将生物学分为了两个时代:PCR前时代和PCR后时代。”

  ——《纽约时报》评凯利·穆利斯的成就

  凯利·穆利斯(KaryB.Mullis)是PCR技术的发明人,被尊称为“PCR”之父,2019年8月7日因病与世长辞,享年74岁。《纽约时报》对他的评价可以说毫不夸张,现代生物学腾飞发展的三十年始于PCR技术,PCR技术则始于穆利斯教授的“公路灵感”。

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图片来源:诺贝尔奖官网

  「那是在 1983 年的一天,我正开车疾驰在高速公路上。渐渐地,我的视线模糊了,思绪飘回到实验室…… 突然,我好像看见 DNA 分子近在咫尺,蓝色的、粉色的,都那么鲜亮,纠缠在一起……」

  穆利斯教授在他的自传《心灵裸舞》中回忆到,或许穆利斯教授自己也不会想到,脱胎于他这番奇思异想的PCR技术会成为日后所有生物实验室不可或缺的技术手段和工具,并逐渐发展成荧光定量PCR和数字PCR,叩开了精准医学的大门。

PCR技术原理.jpg

  PCR技术原理

  PCR全称聚合酶链反应,是体外人工选择性扩增DNA的一种方法,如上图所示,一个PCR循环包含三个步骤:变性(Denaturation)、退火(Annealing)、延伸(Elongation)。每一轮循环将使目的DNA扩增一倍,一次循环需2-4分钟,2-3小时便能将目的DNA扩增数百万倍,理论上只要引物足够,就可以无限循环扩增下去。PCR技术解决了体外DNA获取困难的问题,极大地推动了生命科学的研究进展。

  精进迭代 从凝胶电泳到数字PCR

  最初的PCR是通过凝胶电泳、毛细管电泳等方法对产物进行检测,操作繁琐易交叉污染且只能定性分析,为了实现定量分析,简化操作流程,1992年出现了“第二代PCR” 实时荧光定量PCR。

  实时荧光定量PCR(QPCR)是在常规的PCR基础上加入荧光标记探针或相应的荧光染料来实现定量功能,其原理在于随着PCR反应的进行,PCR反应产物不断累计,荧光信号强度也等比例增加,每经过一个循环,收集一个荧光信号强度,从而得到一条荧光扩增曲线图,再对照由已知起始拷贝数的标准品作出的标准曲线即可相对计算出该样品的起始拷贝数。

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实时荧光定量PCR原理

  实时荧光定量PCR(QPCR)是目前市场上最主流的PCR技术,成熟应用于各种分子生物学研究和医学研究之中,但依赖CT值的相对定量方式,灵敏度低等特征限制了其在很多临床领域的应用。

  1999年,Bert Vogelstein和Kenneth W. Kinzler首次提出了“第三代PCR”数字PCR的概念,其核心思想在于借助微液滴或微腔室,将DNA模板分散在不同的独立反应体系中,实现单个模板扩增,扩增结束后根据各个反应单元荧光信号的有或无进行统计学分析(泊松分布),从而不依靠标准曲线完成绝对定量。 

数字PCR原理.jpg

 数字PCR原理

  数字PCR技术是当前最精准、最灵敏的基因检测技术,在肿瘤早期筛查及伴随诊断 、无创产前筛查、致病微生物检测等液态活检领域应用广泛。与其他基因检测技术相比,数字PCR检测速度快、操作简便、结果易读、成本低廉,这些优势使其更适用于临床检测,是精准医疗实现平民化、大众化的最佳选择。

  芯片式、微滴式数字PCR

  主流数字PCR按微液滴的制备方法分为两大类:芯片式数字PCR(cdPCR)和微液滴式数字PCR(ddPCR)。

  芯片式数字PCR采用高密度的微流控芯片技术,一个芯片中有多达数万的反应微孔,将样本均匀的分散到这些微孔中,达到相互隔离的目的。

  液滴式数字PCR采用油包水乳化微滴技术,借助微滴发生器,将样品均分成数万个微液滴,每个液滴都是一个单独的反应器。

  虽然数字PCR技术的原理并不复杂,但早期微液滴制备过程得到微液滴数量和均匀性很难达到要求,一直限制了数字PCR技术的发展,直到近几年,微流控芯片、油包水乳化液滴和纳米制造等技术的出现和快速发展,数字PCR才成功实现了市场化。

  目前,国际数字PCR市场被美国两大基因科技公司Thermo-Fisher的QuantStudio 3D系统(cdPCR)和Bio-Rad的QX200系统(ddPCR)所占有。近年来,我国逐渐将精准医疗上升到战略层次,鼓励国内企业自主研发,国内具有精准医疗硬核研发实力的基因科技公司如小海龟科技、新羿生物、顺德永诺生物、科维思等也相继推出数字PCR产品,争相进入市场。


  小海龟科技自2015年开始打造BioDigital系列数字PCR,从无到有,另辟蹊径,全自主探索出基于高分子聚合物材料的柔性生物芯片的数字PCR技术方案,和以Thermo-Fisher和Bio-Rad两家跨国巨头为代表的两大数字PCR路线相比,耗材成本更低、信噪比更高、反应时间更短、更易实现多路荧光检测。系列产品具有如下特点:

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BioDigital·華 数字PCR

  • 拥有全球知识产权——液滴生成、检测分析一体化

  • 创新柔性微流控芯片——制造成本低、全封闭、防污染能力强

  • 2万/20万有效微滴——检测限低至0.001%

  • 4-5路荧光检测通道——单次反应可以实现更多重PCR反应

  • 样本检测通量大——1~96个样本可灵活组合

  • 追溯原始数据图——实验结果直观参考

  • 应用场景全覆盖——开创性的实现扩增过程的实时监测

  现阶段,小海龟科技已自建完成国内首条柔性微流控生物芯片智能化生产线、高端医疗器械及分子诊断试剂GMP生产线,率先实现了数字PCR技术成套系统全流程产业化。

  小海龟科技始终以产品创新为源动力,致力于使数字PCR技术更经济、更高效、更灵活、更全面地覆盖所有使用场景,真正实现将数字PCR科技创新惠及到每个普通老百姓的健康生活。


  本文作者:吴东平 教授

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  作者简介:复旦大学微电子学院和遗传与发育协同创新中心教授,上海小海龟科技有限公司创始人。致力于集成电路、传感器和生命健康科学领域的交叉融合研究,研发完成了数字PCR基因检测成套系统和半导体高通量测序系统,在基因检测核心技术与精准医疗应用领域具有大量的研究成果。

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编辑: 毛晓洁
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